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Rapporti scientifici volume 13, numero articolo: 4744 (2023) Citare questo articolo

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Il rilevamento multiplex dei biomarcatori in tempo reale è fondamentale per una diagnosi sensibile e accurata nel punto di utilizzo. Questo scenario pone enormi sfide per il rilevamento e l’identificazione di segnali di varia forma e qualità al limite del limite segnale-rumore. Qui, dimostriamo un robusto schema di identificazione del bersaglio che utilizza una rete neurale profonda (DNN) per il rilevamento multiplex di singole particelle e biomarcatori molecolari. Il modello combina il rilevamento rapido delle particelle wavelet con l'analisi della trasformata di Fourier a breve termine, seguita dall'identificazione DNN su un dispositivo edge specifico per l'intelligenza artificiale (scheda Google Coral Dev). L'approccio è convalidato utilizzando l'eccitazione ottica multi-spot degli acidi nucleici batterici di Klebsiella Pneumoniae che fluiscono attraverso un chip di guida d'onda optofluidica che produce segnali di fluorescenza di varia ampiezza, durata e qualità. Il multiplexing 3× senza amplificazione in tempo reale è dimostrato con eccellente specificità, sensibilità e un'accuratezza di classificazione del 99,8%. Questi risultati mostrano che un design DNN minimalista ottimizzato per i dispositivi mobili fornisce un quadro robusto per il rilevamento accurato dei patogeni utilizzando dispositivi diagnostici compatti e a basso costo.

Il rilevamento e l'identificazione delle biomolecole sono parti essenziali dei dispositivi diagnostici nel campo del controllo delle malattie. La pandemia di COVID-19 ha accelerato l’uso dei test domiciliari per la diagnosi precoce e il monitoraggio ripetuto, e si può prevedere che l’analisi presso il punto di cura si espanderà in volume e capacità. Alcune delle sfide qui riguardano la preparazione dei campioni e la gestione dei fluidi, la sensibilità e la specificità, l'acquisizione e l'elaborazione dei dati, la portabilità e la connettività1,2. Varie micro e nanotecnologie hanno prodotto sensori applicabili alla diagnostica molecolare su chip. Ad esempio, è stato introdotto un biosensore complementare basato su semiconduttore metallo-ossido (CMOS) che utilizza un design nanomeccanico a ponte di membrana3 per misurare la concentrazione di un farmaco fenitoina in un campione liquido con un approccio microelettromeccanico (MEMS). I dispositivi analitici cartacei (PAD) sono un altro buon esempio di diagnostica point-of-care. Si sono evoluti negli ultimi dieci anni grazie a proprietà quali basso costo, biocompatibilità, progettazione e utilizzo semplici e flessibilità nel perseguire unità di test monouso a prezzi accessibili4,5,6. Sebbene l'analisi del campione possa essere eseguita in pochi minuti, questi dispositivi hanno un limite di rilevamento relativamente alto (LOD > µM), richiedendo tempo di amplificazione e coltivazione (di solito diverse ore) per un'analisi altamente sensibile degli acidi nucleici. Tra le tecniche basate sull'amplificazione, la reazione a catena della polimerasi quantitativa (qPCR) è ancora il metodo gold standard nella maggior parte degli strumenti di test di laboratorio grazie alla sua sensibilità molto elevata (~ 100 copie/ml) e versatilità7,8,9. Una nuova tecnica a tubo singolo con un processo di amplificazione relativamente economico e semplice chiamato amplificazione isotermica mediata da loop (LAMP) è diventata più popolare negli ultimi dieci anni10,11. In alcune applicazioni potrebbe essere auspicabile un'ulteriore semplificazione del test basata sull'eliminazione delle fasi di amplificazione e sull'integrazione su scala chip. Nel regime di sensibilità a singola molecola, i dispositivi nanoporosi come biosensori elettrici si sono dimostrati promettenti come strumenti diagnostici ad altissima sensibilità senza etichetta e senza amplificazione12,13. La sensibilità di rilevamento di singole molecole basata sulla fluorescenza è stata dimostrata nei dispositivi a guida d'onda optofluidica, consentendo il rilevamento senza amplificazione degli RNA del virus Ebola (EBOV) con bassi limiti di rilevamento (LoD) fino a 90 aM14,15. L'analisi multiplex è stata implementata su questi sensori optofluidici ARROW a molecola singola creando modelli di eccitazione multi-spot dipendenti dallo spettro e/o dallo spazio all'uscita delle guide d'onda di interferenza multimodale (MMI)16,17. Il modello spaziale multi-spot si traduce in un segnale temporale multi-picco (vedere Fig. 1c) che può essere facilmente identificato da algoritmi di elaborazione del segnale che riconoscono la caratteristica differenza temporale ∆t tra i picchi di fluorescenza di un singolo target. È stato dimostrato un rilevamento multiplex fino a 7× degli acidi nucleici utilizzando la traduzione spettrale, spaziale e dipendente dalla velocità del modello di eccitazione in segnali di fluorescenza a picco multiplo dipendenti dal tempo17,18. L'uso di segnali deliberatamente modellati è stato utilizzato anche in altri contesti. Ad esempio, la codifica del segnale simile alle telecomunicazioni è stata implementata nella citometria cellulare utilizzando il rilevamento di impulsi elettrici resistivi in ​​cui il modello di eventi generato dalle cellule in flusso dipende dalla disposizione degli elettrodi e decodifica i segnali digitali da diversi canali con una precisione molto elevata19,20, 21. È stato studiato un biosensore elettrico con elettrodi multidito per dimostrare l'effetto dell'aumento del numero di elettrodi nel rapporto segnale-rumore (SNR) di impedenza22,23,24,25. La codifica dei segnali nelle applicazioni di biorilevamento può trarre vantaggio da tecniche di codifica delle informazioni più complicate come il multiplexing, la correzione degli errori e l'identificazione23,26,27 con una recente tendenza verso le tecniche di apprendimento automatico28. L'ottimizzazione del metodo di analisi del segnale scelto è di fondamentale importanza poiché le imperfezioni del dispositivo nel mondo reale tendono a compromettere la qualità del segnale e, quindi, l'affidabilità dell'analisi del segnale. Nel caso di un dispositivo a guida d'onda MMI optofluidica, questi possono includere variazioni indotte dalla fabbricazione nei modelli di eccitazione MMI, variazioni di velocità dovute alla dinamica fluidica dei bersagli fluenti e variazioni del rapporto segnale-rumore causate da una gamma di intensità del segnale di fluorescenza. Questi tipi di non ideali si aggiungono alle limitazioni della qualità del segnale affrontate dai dispositivi point-of-care, dove i componenti dovrebbero essere prodotti a basso costo e i fattori ambientali spesso influiscono sulla qualità del segnale. Queste sfide intrinseche possono essere alleviate da un potente approccio di analisi del segnale che può operare in tempo reale.